Abgabe von Streptomycin an den Dickdarm der Ratte mittels elektrogesponnener Nanofasern

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21503 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mit Arzneimitteln beladene elektrogesponnene Nanofasern sind potenzielle Arzneimittelträgersysteme, die die Behandlung von Krankheiten optimieren und gleichzeitig die Auswirkungen auf kommensale Mikroben verringern können. Die Machbarkeit von Streptomycin-beladenen Pullulan-Nanofasern, die durch ein grünes Elektrospinning-Verfahren unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel hergestellt wurden, wurde bewertet. Wir führten eine Rattenstudie durch, an der eine Gruppe teilnahm, die mit Streptomycin-beladenen Nanofasern behandelt wurde (STR-F, n = 5), eine Gruppe, die mit ähnlichen Konzentrationen von Streptomycin im Trinkwasser behandelt wurde (STR-W, n = 5) und eine Gruppe, die nicht mit Streptomycin beladen war. behandelte Kontrollgruppe (CTR, n = 5). Streptomycin wurde erfolgreich in Nanofasern geladen und von diesem Vehikel abgegeben, wodurch die Menge des im Ileum-Kompartiment des Darms freigesetzten Arzneimittels minimiert wurde. Verschluckte Streptomycin-resistente E. coli besiedelten bis zu 106 KBE/g Kot, was eine selektive Wirkung von Streptomycin zeigt, selbst wenn es in den geringen Mengen verabreicht wird, die durch die Verabreichung auf Nanofaserbasis zulässig sind. Die 16S-Amplikonsequenzierung der einheimischen Mikrobiota zeigte unterschiedliche Effekte in den drei Gruppen. Eine Zunahme von Peptostreptococaceae im Blinddarm von STR-F-Tieren könnte darauf hindeuten, dass die Fermentation von Nanofasern direkt oder indirekt das Wachstum von Bakterien innerhalb dieser Familie förderte. Unsere Ergebnisse verdeutlichen relevante Eigenschaften elektrogesponnener Nanofasern als neuartiges Vehikel für die Abgabe antimikrobieller Wirkstoffe an den Dickdarm.

Antibiotika sind für die Kontrolle und Vorbeugung von Infektionen von entscheidender Bedeutung, können aber auch Nichtzielbakterien im Darmlumen stören1,2,3. Zu den negativen Auswirkungen antimikrobieller Therapien gehören die Störung der kommensalen Darmmikrobiota sowie die Entwicklung arzneimittelresistenter Bakterien3,4.

Entwicklungen in der Biomaterialtechnologie haben fortschrittliche Arzneimittelträger wie Nanofasern hervorgebracht, die dazu beitragen könnten, Herausforderungen bei der Wirksamkeit therapeutischer Arzneimittel zu überwinden, das Risiko der Entwicklung einer antimikrobiellen Resistenz zu verringern5,6 und möglicherweise die Auswirkungen auf die Darmmikrobiota zu minimieren.

Interessanterweise hat die Arzneimittelabgabe durch nanostrukturierte Träger relevante Merkmale wie eine effiziente Hemmung des Bakterienwachstums und eine verzögerte Freisetzung gezeigt7. Darüber hinaus erregen Arzneimitteltransportsysteme auf Basis von Polysacchariden, insbesondere Pullulan, zunehmende Aufmerksamkeit, da sie ungiftig, stabil, biokompatibel und biologisch abbaubar sind8,9,10,11. Elektrospinnen, ein einfaches und schnelles System zur Bildung von Nanofasern, schreitet voran bei der Schaffung neuer Arten von Nanostrukturen, darunter mehrschichtige Blätter12,13, Nanohybride14,15 und Kern-Schale-Nanofasern14,16. Kürzlich wurden verschiedene potenzielle Elektrospinning-Strategien zur Manipulation des Arzneimittelfreisetzungsverhaltens für eine verbesserte therapeutische Wirkung untersucht17,18. Im Gegensatz zur weit verbreiteten Verwendung von elektrogesponnenen Nanofasern für Anwendungen zur Arzneimittelverabreichung umfassen mehrere eingeführte Systeme auf der Basis elektrogesponnener Nanofasern organische Lösungsmittel im Herstellungsverfahren6. Hier haben wir ein umweltfreundliches Verfahren verwendet, das Pullulan als Biopolymer in Lebensmittelqualität und Wasser als Lösungsmittel umfasst. Pullulan ist ein lineares Polysaccharid, das aus dem Pilz Aureobasidium pullulans hergestellt wird und aus Einheiten vom Maltotriose-Typ besteht, dh α-(1 → 6)-verknüpft mit (1 → 4)-α-d-Triglucosiden19. Dieses einzigartige Verbindungsmuster führt zu einer hohen Haftung und Zugfestigkeit von Pullulan20. Im Gegensatz zu vielen anderen Polysacchariden löst sich Pullulan aufgrund der geringen Wasserstoffbrückenbindung leicht in Wasser. Es bietet ein gutes Verarbeitungspotenzial zur Bildung von Filmen und Fasern und weist aufgrund der nicht hygroskopischen Natur eine beträchtliche intermolekulare mechanische Festigkeit8,19,21,22 auf. Darüber hinaus ist dieses Biopolymer aufgrund seiner nicht mutagenen, nicht krebserregenden, biologisch abbaubaren, mukoadhäsiven und zytoadhäsiven Eigenschaften ein geeigneter Träger für Anwendungen zur Arzneimittelabgabe6,9,13.

Da antimikrobielle Resistenzen eine der größten globalen Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit darstellen und wir uns derzeit am Rande einer Post-Antibiotika-Ära23 befinden, wird die ortsspezifische antimikrobielle Verabreichung bevorzugt. Ansätze, die die lokale Konzentration von Antibiotika nur dort erhöhen, wo sie wirken sollen, könnten eine Möglichkeit sein, die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen zu verringern. Ziel dieser Studie war es daher, die Auswirkungen der Einnahme von Streptomycin-beladenen Pullulan-Nanofasern auf die Darmbakteriengemeinschaft bei Ratten im Vergleich zur Streptomycin-Verabreichung über das Trinkwasser zu beschreiben. Zusätzlich wurde die selektive Wirkung auf einen aufgenommenen resistenten Bakterienstamm bewertet.

Mit der Kirby-Bauer-Methode durchgeführte Scheibendiffusionstests bestätigten, dass die antimikrobielle Aktivität von Streptomycin nach dem Laden in elektrogesponnene Fasern erhalten blieb. So hemmten Streptomycin-beladene Nanofasern das Wachstum empfindlicher E. coli- und S. aureus-Stämme (Abb. 1). Insgesamt kommen wir zu dem Schluss, dass die Einkapselung des Arzneimittels keinen Einfluss auf die antimikrobiellen Eigenschaften des Arzneimittels hatte. Somit waren elektrogesponnene Nanofasern geeignet, das optimale therapeutische Niveau des antimikrobiellen Arzneimittels in vitro aufrechtzuerhalten. Eine ähnliche Studie mit Amoxicillin hat gezeigt, dass die Einbettung antimikrobieller Nanofasern die Freisetzung und Aktivität des Arzneimittels nicht beeinträchtigt24. Daher können elektrogesponnene Nanofasern für verschiedene Anwendungen im Bereich der Arzneimittelabgabe relevant sein.

Scheibendiffusionstest. (a) S. aureus-Scheibendiffusionsergebnisse von mit Streptomycin beladenem Pullulan und (b) E. coli-Scheibendiffusionsergebnisse von mit Streptomycin beladenem Pullulan.

Eine Rattenstudie wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von Streptomycin-tragenden Nanofasern auf den Kolonisierungsgrad von Streptomycin-resistenten E. coli MG1655-K12 zu untersuchen. Vor der Inokulation wurde in den Stuhlproben dieser Tiere keine Hintergrundresistenz gegen Streptomycin oder Gentamycin festgestellt (Daten nicht gezeigt). Am ersten und zweiten Tag nach der Inokulation wurden in Stuhlproben von Ratten, die Streptomycin entweder in Nanofasern (STR-F) oder im Trinkwasser (STR-W) verkapselt erhielten, deutlich mehr Streptomycin-resistente E. coli gefunden als in der Kontrolle (CTR)-Gruppe (Abb. 2a). Es wurde kein Unterschied zwischen STR-F und STR-W beobachtet (Abb. 2a). In Blinddarmproben der STR-W-Tiere wurde eine höhere Anzahl resistenter E. coli gefunden, während der Unterschied zwischen der STR-F-Gruppe und der CTR nicht signifikant war (Abb. 2b, c). In den am 3. Tag entnommenen Dickdarm- und Stuhlproben wurde zwischen keiner der Gruppen ein Unterschied in der Anzahl resistenter E. coli beobachtet, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass die Streptomycin-Behandlung sowohl bei STR-W als auch bei STR-F am 2. Tag beendet wurde.

CFU zählt. (a) E. coli-KBE-Zahlen pro Gramm Stuhlmaterial am Tag 1, Tag 2 und Tag 3; (b) E. coli-KBE-Zahlen pro Gramm Blinddarminhalt an Tag 1, Tag 2 und Tag 3; (c) E. coli-KBE-Zahlen pro Gramm Dickdarminhalt am Tag 1, Tag 2 und Tag 3. *(P < 0,05); **(P < 0,01); *** (P < 0,001). Am ersten Tag wurden von CTR nur vier Proben erhalten.

Streptomycin, verabreicht in einer Menge von 5 g/L im Trinkwasser, wird seit Jahrzehnten in Tiermodellen eingesetzt, um fakultativ anaerobe Bakterien zu unterdrücken und so aufgenommenen Streptomycin-resistenten Proteobakterienarten die Überwindung der Kolonisierungsbarriere zu ermöglichen25,26,27. Im aktuellen Experiment haben wir eine viel niedrigere Konzentration (0,25 g/L) im Trinkwasser der STR-W-Ratten angewendet, um die absolute Menge von 7 mg Streptomycin zu erreichen, die den STR-F-Ratten als Nanofasern verabreicht wurde. Dennoch zeigen unsere Ergebnisse, dass es möglich ist, bei dieser 20-fach niedrigeren Konzentration als dem derzeit angewendeten Standard eine Darmvermehrung resistenter Bakterien zu erreichen.

Die Messung des tatsächlichen Wasserverbrauchs während des Experiments ergab, dass der Gesamtverbrauch von Streptomycin durch STR-W-Ratten etwa 12,5 mg betrug, wenn man eine geschätzte Verschüttung von 50 % berücksichtigt. Wie oben erwähnt, betrug die über Nanofasern an STR-F-Ratten während des Experiments verabreichte Streptomycin-Dosierung etwa 7 mg.

Die im Darm aus Nanofasern freigesetzte Streptomycinkonzentration wurde durch ELISA des am dritten Tag gewonnenen Rattendarminhalts bestimmt. Interessanterweise beobachteten wir eine signifikant (P < 0,005) niedrigere Streptomycinkonzentration in den Ileumproben der STR-F-Gruppe im Vergleich zur STR-W-Gruppe (Abb. 3). Wir spekulieren, dass sich die beschichteten Gelatinekapseln im Dünndarm aufzulösen beginnen und die elektrogesponnenen Pullulanfasern freisetzen, die mukoadhäsive Eigenschaften haben9. Die Pullulan-Nanofasern lösen sich dann auf und bilden ein geleeartiges, schleimadhäsives Konstrukt, das den Wirkstoff teilweise durch das Ileum zurückhält und in den Dickdarm gelangt, wo nach und nach weitere Wirkstoffe freigesetzt werden.

Streptomycin-Konzentrationen. Heatmap, die die ungefähren Konzentrationen von Streptomycin in Ileum, Blinddarm und Dickdarm widerspiegelt. Die STR-W- und STR-F-Werte unterscheiden sich in Ileumproben (P < 0,005), während sich die Konzentrationen in Blinddarm und Dickdarm zwischen den beiden Gruppen nicht unterscheiden. Der Test war über 50 ng/ml gesättigt. Die Abbildung wurde in GraphPas Prism erstellt, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben.

In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen haben Kern-Schale-Fasern, die durch koaxiales Elektrospinnen hergestellt werden, zuvor eine erfolgreiche anhaltende Freisetzung hydrophiler Wirkstoffe wie Streptomycin gezeigt . Im Hinblick auf Anwendungen zur Medikamentenverabreichung unter Verwendung von Pullulan-Nanofasern gibt es mehrere Studien, die sich auf die schnell auflösenden Eigenschaften von Pullulan konzentrieren und es für schnelle Verabreichungsansätze über den bukkalen Weg8,19,29,30 oder für Wundauflagenanwendungen6,31 empfehlen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass antibiotikabeladene Pullulan-Nanofasern aufgrund der mukoadhäsiven Eigenschaften des gelösten Pullulans auch für die Abgabe in den Dickdarm geeignet sind.

Die Sequenzierung von 16S-rRNA-Gen-Amplikons wurde durchgeführt, um die Wirkung der Streptomycin-Behandlung auf die Darmmikrobiota zu bewerten. Der mikrobielle Reichtum war in Stuhlproben der Gruppen STR-F (P = 0,008) und STR-W (P = 0,007) im Vergleich zur CTR-Gruppe signifikant verringert (Abb. 4). Im Blinddarm wurde in der CTR-Gruppe ein etwas höherer Reichtum beobachtet als in STR-F-Proben.

Mikrobieller Reichtum in Blinddarm, Dickdarm und Kot. Proben werden durch Punkte angezeigt, während horizontale Balken die Durchschnittswerte markieren. Die P-Werte stammen aus dem Permutationstest des Mittelwerts und werden wie folgt angezeigt: *(P < 0,05); **(P < 0,01); ***(P < 0,001).

Die Beta-Diversität wurde zwischen Gruppen basierend auf der Bray-Curtis-Unähnlichkeit verglichen und mit nichtmetrischer mehrdimensionaler Skalierung (NMDS) visualisiert. Drei unterschiedliche Cluster stellten jeweils STR-W-, STR-F- und CTR-Proben dar (Abb. 5a). Insgesamt war die Behandlung einflussreicher als der Ort im Darm, basierend auf dem PERMANOVA-Modell (0,27 [R2 für Gruppe] vs. 0,09 [R2 für Ort], P = 0, Permutationstest mit 100 Iterationen). Der paarweise Vergleich aller Gruppen an jedem Standort war in allen Fällen signifikant, mit Ausnahme der Stuhlproben der beiden STR-behandelten Gruppen (Abb. 5b).

Mikrobielle Zusammensetzung in Blinddarm, Dickdarm und Kot. (a) Die gesamten mikrobiellen Zusammensetzungen der Proben auf ASV-Ebene wurden mit einem Bray-Curtis-Abstand bewertet und mit nichtmetrischer mehrdimensionaler Skalierung (NMDS) visualisiert. (b) Eine Tabelle, die den Vergleich der Beta-Diversität zwischen Gruppen an einem Standort zeigt, und die P-Werte werden aus den PERMANOVA-Modellen unter Verwendung der Bray-Curtis-Distanz abgeleitet. (c) Balkendiagramme, die die taxonomische Zusammensetzung der zehn am häufigsten vorkommenden Stämme zeigen.

Zusammengenommen machten Bacteroidetes und Firmicutes mehr als 99 % der in Rattenproben identifizierten ASVs aus. Wir fanden eine signifikante Verringerung der relativen Häufigkeit von Firmicutes und einen entsprechenden relativen Anstieg von Bacteroidetes in den STR-W- und STR-F-Gruppen in Proben aus Blinddarm, Dickdarm und Kot (Abb. 5c).

Auf Familienebene wurden im Blinddarm von STR-F-Tieren im Vergleich zu STR-W- und CTR-Tieren geringere Konzentrationen von Lactobacillaceae gefunden (Abb. 6), während eine höhere Häufigkeit von Peptostreptococcaceae, insbesondere Romboutsia, beobachtet wurde (Abb. 6). . Peptostreptococcaceae sind bei gesunden Ratten Kommensalen32, und Romboutsia, das zur Familie der Peptostreptococcaceae gehört, besteht aus anaeroben Mikroorganismen, die für die Nutzung einer breiten Palette von Kohlenhydraten geeignet sind und für die Proteinsynthese auf exogene Aminosäuren und Peptide angewiesen sind33. Wir spekulieren, dass die beobachteten höheren Konzentrationen dieser Art in der STR-F-Gruppe als in der STR-W-Gruppe auf die Fermentation von Nanofasern im Dickdarm zurückzuführen sind, die direkt oder indirekt das Wachstum von Bakterien innerhalb dieser Familie fördert. Die unverdaulichen Anteile der Nanofasern bestanden aus durch α-1,6-Bindungen verbundenen Maltotriose-Einheiten, die gegen Darmenzyme von Säugetieren resistent sind, aber für die bakterielle Fermentation im Dickdarm zur Verfügung stehen34.

Baumdiagramm, das den Vergleich der relativen Taxonhäufigkeit zwischen Gruppen zeigt. Der größte Knoten in der Mitte sind die Königreichsbakterien. Entlang des Baumzweigs nach außen ist der nächste Knoten die Stammebene, gefolgt von Klasse, Ordnung, Familie und Gattung. Die Größe des Knotens ist proportional zur mittleren relativen Häufigkeit in der entsprechenden phylogenetischen Ebene. Ein Knoten wird beschriftet und gefärbt, wenn er signifikant unterschiedliche relative Häufigkeiten (Permutationstest) zwischen den Gruppen aufweist. Die Abbildung wurde in R erstellt, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben.

Streptomycin kann in elektrogesponnene Nanofasern eingebaut werden, ohne die antibakterielle Aktivität zu verlieren, und darüber hinaus kann es durch die Dosierung mit eingekapselten Nanofasern erfolgreich durch den Dünndarm zurückgehalten und in den Dickdarm von Ratten abgegeben werden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass elektrogesponnene Nanofasern eine fortschrittliche Alternative für die Abgabe antimikrobieller Wirkstoffe an den Dickdarm darstellen. Dieser Ansatz ermöglicht wahrscheinlich eine Verringerung der Menge an Antibiotika, die für eine wirksame Wirkung erforderlich sind, und verringert dadurch das Risiko der Entwicklung von Resistenzen sowie eine geringere Störung der einheimischen Mikrobiota. Tatsächlich wurde festgestellt, dass die Abgabe durch Nanofasern die Mikrobiota auf andere Weise beeinflusst als die Abgabe über das Trinkwasser.

Pullulan wurde freundlicherweise von HAYASHIBARA CO., LTD (Japan) zur Verfügung gestellt. Das Wasser wurde mit einem Milli-QPlus 185-Wasserreinigungssystem (Millipore, Bedford, MA) mit einem spezifischen Widerstand von mehr als 18 MΩ·cm gereinigt. Streptomycin-Standardscheiben (25 µg pro Scheibe) wurden von Oxoid, Dänemark, gekauft. Hexamethyldisilazan (HMDS) wurde von Merck (Deutschland) bezogen. Streptomycin, Gentamycin, Trehalose und RSM (Magermilchpulver) wurden von Sigma-Aldrich, Dänemark, bezogen.

Streptomycin wurde in elektrogesponnene Pullulan-Nanofasern mit Endkonzentrationen von 1 bzw. 10 % (Gew./Gew.; Gewicht von Streptomycin im Verhältnis zum Gewicht des Polymers) geladen. Zur Einkapselung von Streptomycin in Pullulan wurde Streptomycin-Pulver zunächst in Wasser gelöst und dann wurde der Lösung Pullulan-Pulver zugesetzt, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Zur Herstellung von 1 % oder 10 % Streptomycin zu Pullulan-Konstrukten (Gew./Gew.) wurde zunächst eine Streptomycinlösung von 0,2 % oder 2 % (Gew./Vol.) in Wasser unter leichtem Rühren bei 25 °C für 4 Stunden hergestellt. Dann wurde Pullulan-Pulver zugegeben, um eine 20 %ige Lösung (Gew./Vol.) von Pullulan in Wasser herzustellen, und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Beispielsweise wurde Streptomycin zur Herstellung einer 1 % (Gew./Gew.) Streptomycin: Pullulan-Nanofaserplatte in Wasser (Konz. 2 mg/ml) unter leichtem Rühren bei 25 °C für 4 Stunden gelöst. Dann wurde Pullulan-Pulver (0,2 g) zu der 1-ml-Lösung hinzugefügt, um die gewünschte Endkonzentration von 20 % Pullulan in Wasser für optimales Elektrospinnen zu erreichen. Abschließend wurde die Lösung durch einen 25-mm-Filter (Sigma Aldrich) sterilfiltriert und zum Elektrospinnen verwendet.

Für das Elektrospinnen wurde ein maßgeschneidertes konventionelles Elektrospinnensystem verwendet, das eine Hochspannungsquelle (Glassman, FJ50P2.4-F22), eine Spritzenpumpe (Aladdin, AL-1000), verbunden mit einer Spritze mit einer 21-G-Injektionsnadel, und einen statischen Kollektor umfasste . Die optimierten Spinnparameter wurden auf eine Zufuhrrate von 1 ml/h, eine Spannung von 14–16 kV, einen Abstand von Nadelspitze zu Kollektor von 15 cm, eine Luftfeuchtigkeit von 35 % und eine Temperatur von 25 °C eingestellt. Die Elektrospinnkammer einschließlich der Pumpe und des Kollektors wurde vor Beginn jedes Elektrospinnvorgangs mit EtOH 70 % desinfiziert.

Um zu untersuchen, ob die antimikrobielle Wirksamkeit von Streptomycin nach dem Elektrospinnen erhalten bleibt, führten wir einen Scheibendiffusionstest nach der Kirby-Bauer-Methode durch . Die antibakterielle Aktivität des in Nanofaserblätter geladenen Streptomycins wurde gegen Gram-negativ (Escherichia coli (E. coli) MG1655 subst. K12 (ATCC 47076)) und Gram-positiv (Staphylococcus aureus (S. aureus) (ATCC 2928)) analysiert. Streptomycin-empfindliche Bakterien. Die E. coli- und S. aureus-Stämme wurden über Nacht in Luria Bertani-Platten (LB) bei 37 °C gezüchtet. Für jede Probe wurde ein Inokulum hergestellt und die Trübung der Suspension in einem Densitometer (Sensititre-Nephelometer, Thermo Fisher, Dänemark) im Vergleich zum 0,5-McFarland-Standard eingestellt. Anschließend wurden 100 Mikroliter des Inokulums auf Mueller-Hinton-Agarplatten verteilt. Die elektrogesponnenen Folien mit 10 µg und 100 µg (aus 1 und 10 % w/w Streptomycin:Pullulan-Nanofasern) wurden mit einer Biopsie-Stanze von 6 mm geschnitten und dann neben die Standard-Streptomycin-Scheiben mit demselben Durchmesser (25 µg) gelegt (Oxoid , Dänemark) als Kontrolle. Als Negativkontrollen wurden nicht mit Streptomycin beladene elektrogesponnene Folien (Pullulan-Nanofasern) einbezogen. Die Proben wurden 16–18 Stunden lang bei 35 °C inkubiert. Der Durchmesser der Hemmzone wurde gemessen und mit den Bruchpunktwerten der EUCAST-Richtlinien (https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_11.0_Breakpoint_Tables.pdf) verglichen.

Um Ratten Antibiotika-beladene Nanofasern zu verabreichen, wurden die elektrogesponnenen Schichten aus 10 % Streptomycin:Pullulan manuell geschnitten, um quadratische Partikel mit einer Länge von etwa 1 mm zu erhalten. Dann wurden hartschalige Gelatinekapseln (Torpac Größe 9) mit einer 12 %igen (Gew./Vol.) Lösung von Eudragit L100 in IPA überzogen, wobei Dibutylsebacat als Weichmacher in einem 5 % G/G-Verhältnis relativ zu Eudragit hinzugefügt wurde. Schließlich wurden die Kapseln mit 12 mg Partikeln (entspricht 1,2 mg Streptomycin pro Kapsel) gefüllt, bevor sie den Ratten verabreicht wurden.

Um herauszufinden, ob die mit Streptomycin beladene elektrogesponnene Nanofaserfolie die Etablierung streptomycinresistenter Bakterien im Darm beeinflusst, führten wir eine Rattenstudie durch, bei der die Tiere oral mit dem streptomycinresistenten mCherry-markierten E. coli MG1655-Subst. geimpft wurden. K12, Taxon Identifier 511145 (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A4D6FVK6) in Verbindung mit Streptomycin, entweder als eingekapselte Nanofasern, im Trinkwasser oder ohne Streptomycin als Kontrolle (Abb. 7). Der fluoreszenzmarkierte Stamm wurde ausgewählt, um eine einfache mikroskopische Überprüfung zu ermöglichen.

Studienübersicht. Schematische Darstellung der In-vivo-Studie, die CTR (Kontrolle) darstellt, die eine Placebo-Gelatinekapsel mit harter Schale erhielt, STR-F (Streptomycin-beladene Nanofasern), die eine mit Eudragit 100S beschichtete und mit Antibiotika-beladenen Pullulan-Partikeln beladene Kapsel erhielt zweimal täglich, und STR-W (Streptomycin im Trinkwasser) erhielt eine Placebo-Hartgelatinekapsel und Streptomycin im Trinkwasser (0,25 g/L). Alle Gruppen erhielten eine Einzeldosis von 108 KBE Streptomycin-resistenter Escherichia coli. Die Abbildung wurde von den Autoren in BioRender erstellt.

Fünfzehn männliche 8 Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten (Charles River) wurden in drei Fünfergruppen eingeteilt und einzeln in Scantainern (Scanbur) gehalten. Nach einer Akklimatisierungszeit von sieben Tagen wurden die Tiere mit Streptomycin entweder im Trinkwasser (STR-W) oder innerhalb von Partikeln aus elektrogesponnenen Nanofasern (STR-F) behandelt oder erhielten kein antimikrobielles Medikament (CTR). Die CTR-Ratten erhielten eine Placebo-Gelatinekapsel mit harter Schale, STR-F-Ratten erhielten 3 Tage lang (Tag 0, 1 und 2) zweimal täglich eine hartschalige Gelatinekapsel, die wie oben beschrieben mit antibiotikabeladenen Pullulanpartikeln gefüllt war STR-W-Ratten erhielten für die gleichen drei Tage eine leere Placebo-Hartgelatinekapsel und Streptomycin im Trinkwasser (0,25 g/L) (Abb. 7). Wir strebten eine Konzentration im Trinkwasser an, die dazu führen würde, dass der Gesamtverbrauch an Streptomycin durch die STR-W-Ratten den ungefähr 7 mg entspricht, die den STR-F-Ratten verabreicht wurden, wenn man bedenkt, dass der durchschnittliche Wasserverbrauch zwischen ca. 30–50 ml Wasser/Tier/Tag. Für diese Studie wurden die Streptomycin- und Gentamycin-resistenten E. coli wie zuvor beschrieben 16 Stunden lang auf LB-Agar (SSI Diagnostica A/S) inkubiert. Eine Kolonie wurde über Nacht/16 Stunden bei 37 °C unter Schütteln in LB-Brühe übertragen, die mit 20 µg/ml Gentamycin und 100 µg/ml Streptomycin ergänzt war. Die Kultur wurde 10 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert, gewaschen und in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Zelldichte von 109 KBE/ml resuspendiert. Vierundzwanzig Stunden nach Beginn der Streptomycin-Behandlung erhielten alle Gruppen eine Einzeldosis von etwa 108 KBE des Stammes. Die Tiere wurden während des gesamten Experiments gefüttert und erhielten Wasser nach Belieben.

Stuhlproben (ungefähr 1 g) wurden vor der Inokulation und 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Inokulation gesammelt. Nach 72 Stunden wurden die Tiere durch CO2-Erstickung und anschließende Enthauptung eingeschläfert. Ratten wurden präpariert und Lumeninhalte wurden aseptisch aus den distalen Ileum-, Blinddarm- und Dickdarmregionen gesammelt. Der Inhalt dieser Abschnitte wurde gewogen und homogenisiert. Zehnfache Verdünnungen wurden auf LB-Agarplatten verteilt, die je nach Bedarf mit Streptomycin (100 µg/ml) oder Gentamycin (25 µg/ml) (Sigma-Aldrich, Dänemark) ergänzt waren. Die KBE-Zahlen wurden nach 24–72-stündiger Inkubation bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen bestimmt. Zufällige Kolonien wurden mittels Massenspektrometrie mit Bruker Reflex™ III MALDI-TOF (Bruker-Daltonik, Deutschland) analysiert, um sicherzustellen, dass die Isolate E. coli K-12 MG1655 entsprachen.

Um die Menge des im Darmlumen freigesetzten Arzneimittels abzuschätzen, wurde ein ELISA-Test durchgeführt, um die Konzentration von Streptomycin im Stuhlinhalt zu überprüfen. Kotpellets aus Ileum, Blinddarm und Dickdarm wurden analysiert. Die Proben wurden homogenisiert und verdünnt, und das Verfahren wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers des SM Streptomycin ELISA-Kits (Elabscience, USA) (Katalog-Nr. E-FS-E031) durchgeführt. Die optische Dichte (OD) wurde mit einem Mikroplattenlesegerät Biotek EL800 (Agilent, DK) gemessen, das auf 450 nm und 630 nm eingestellt war. Die Daten wurden mit GraphPad Prism Software 8.1.1 verarbeitet.

Die DNA-Extraktion, die Bibliotheksvorbereitung und die anschließende Sequenzierung auf der Ion Torrent-Plattform wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt36. Kurz gesagt bestanden die Proben aus Stuhlproben nach 72 Stunden (n = 15), Proben aus dem Ileum (n = 15) und Proben aus dem Dickdarm (n = 15). Mikrobielle DNA wurde mit ~ 0,2 g Material mit dem Isolationskit DNeasy® PowerLyzer® PowerSoil® von Qiagen extrahiert. Die extrahierte DNA wurde vor der Verwendung bei –20 °C gelagert.

Die Amplifikation der V3-Region des 16S-rRNA-Gens wurde wie folgt durchgeführt: Der PCR-Mastermix bestand aus 0,2 µL Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase (ThermoFisher Scientific F-553L), 4 µL HF-Puffer, 0,4 µL dNTP (10 mM jeder Base). ), 1 µM Vorwärtsprimer (PBU; 5ʹA-Adapter-TCAG-Barcode-CCTACGGGAGGCAGCAG-3ʹ) und 1 µM Rückwärtsprimer (PBR; 5ʹ-trP1-Adapter-ATTACCGCGGCTGCTGG-3ʹ) und 5 ng Community-Kot-DNA in 20 µL Gesamtreaktion Volumen. Beide Primer (TAG Copenhagen A/S) waren mit Sequenzierungsadaptern verbunden und der Vorwärtsprimer enthielt zusätzlich einen eindeutigen 10-bp-Barcode (Ion Xpress™ Barcode Adapters) für jede Probe. Das PCR-Programm bestand aus einer anfänglichen Denaturierung für 30 Sekunden bei 98 °C, gefolgt von 24 Zyklen mit 98 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden und schließlich 72 °C für 5 Minuten, um eine endgültige Verlängerung vor dem Abkühlen zu ermöglichen 4 °C. Für jeden PCR-Lauf waren Kontrollen ohne Vorlage enthalten, die alle weniger als 0,05 ng/µL ergaben. Die PCR-Produkte wurden gemäß der Herstellerempfehlung mit HighPrepTM PCR-Magnetperlen (MAGBIO®, AC-60005) mit einem 96-Well-Magnetständer (MAGBIO®, MyMag 96) gereinigt. Die DNA-Menge wurde mit dem Qubit® dsDNA HS-Assay (InvitrogenTM, Q32851) gemessen und auf dem Chip mit den Systemen Ion OneTouchTM und Ion PGM mit einem 318-Chip v2 mit Hi-Q-Chemie in 200-bp-Läufen sequenziert.

Rohsequenzen wurden mit QIIME237 demultiplext, wobei Barcodes und Primer entfernt wurden. Die erhaltenen Sequenzen wurden weiter gefiltert, um einen Bereich von 125 bis 180 bp zu erreichen. Diese vorverarbeiteten Lesevorgänge wurden mit der DADA2-Pipeline in R38 unter Verwendung der für Ion Torrent empfohlenen Parameter analysiert. Die erhaltenen Amplikonsequenzvarianten (ASVs) wurden anschließend mithilfe der Datenbank Ribosomal Database Project (RDP) (Version 11.5) taxonomisch annotiert.

Die statistische Analyse wurde mit QIIME2, R und GraphPad Prism Software 8.1.1 durchgeführt. Die Proben wurden vor der Berechnung des Gehalts auf eine gleichmäßige Lesetiefe verdünnt. Die KBE-Zahlen, die Streptomycin-Konzentration, der mikrobielle Reichtum und die Taxa-Häufigkeit wurden mit einem zweiseitigen Permutationstest verglichen. ASVs (Amplicon-Sequenzierungsvariante) mit einer relativen Häufigkeit von weniger als 0,01 % wurden vor der weiteren Analyse entfernt. Die Beta-Diversität wurde anhand der Bray-Curtis-Distanzmatrix bewertet und mit der permutationellen multivariaten Varianzanalyse (PERMANOVA) verglichen. Die mit Bäumen dargestellte taxonomische Zusammensetzung wurde mit dem R-Paket „metacoder“39 generiert. Das Signifikanzniveau wurde auf 0,5 festgelegt. Der Vergleich der mittels ELISA ermittelten Streptomycinspiegel im Blinddarm von STR-F- und STR-W-Tieren erfolgte mittels t-Test unter der Annahme gleicher Varianzen.

Die dänische Tierversuchsinspektion hat den Tierversuch unter der Lizenznummer 2020-15-0201-00484 genehmigt. Das Versuchsprotokoll wurde von der BioFacility der DTU vorregistriert. Die Tiere wurden während des Experiments täglich überwacht und das Experiment wurde gemäß den dänischen nationalen Richtlinien durchgeführt und vom Tierschutzausschuss des Instituts für Tierpflege und -nutzung überwacht. Die Methoden werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien angegeben.

Sequenzdaten wurden im NCBI Sequence Read Archive unter der Nummer PRJNA758361 hinterlegt.

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Diese Forschung wurde von der Novo Nordisk Foundation (NNF17OC0026910), MIMIO–Mikrostrukturen, Mikrobiota und oraler Verabreichung sowie von der Dänischen Nationalen Forschungsstiftung (DNRF122) und der Villum Foundation (Grant No. 9301), Centre for Intelligent Drug Delivery and Sensing Using Microcontainers, finanziert und Nanomechanik (IDUN). Die Autoren danken den Tierpflegern von DTU BioF für den Umgang mit den Tieren.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Priscila R. Guerra und Fatemeh Ajalloueian.

Nationales Lebensmittelinstitut, Technische Universität Dänemark, 2800, kg. Lyngby, Dänemark

Priscila R. Guerra, Shaodong Wei, Katja Ann Kristensen, Martin Iain Bahl und Tine Rask Licht

Abteilung für Gesundheitstechnologie, Technische Universität Dänemark, 2800, kg. Lyngby, Dänemark

Fatemeh Ajalloueian & Anja Boisen

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PRG und FA trugen zum Studiendesign, zur Nanofaservorbereitung, zur In-vivo-Studie, zur Datenanalyse und zur Manuskripterstellung bei. KAK trug zur In-vivo-Studie, zum ELISA und zur Sequenzierungsvorbereitung bei. SW trug zur Datenanalyse und Manuskripterstellung bei. MIB, AB und TRL trugen zum Studiendesign, zur Datenanalyse und zur Manuskripterstellung bei. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Tine Rask Licht.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Guerra, PR, Ajalloueian, F., Wei, S. et al. Abgabe von Streptomycin an den Dickdarm der Ratte mittels elektrogesponnener Nanofasern. Sci Rep 12, 21503 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

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Eingegangen: 18. August 2022

Angenommen: 05. Dezember 2022

Veröffentlicht: 13. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

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